Fluoreszenzmikroskop

Ein kompaktes Fluoreszenzmikroskop mit vollelektronischer Steuerung und integrierter Dunkelkammer, um hochauflösende Hellfeld-, Fluoreszenz- und Phasenkontrastbilder zu erhalten. Neben einer intuitiven, benutzerunabhängigen Bilderfassung stehen zahlreiche Analysefunktionen zur Verfügung.

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Modellreihe BZ-X - Kompaktes Fluoreszenzmikroskop

Das kompakte Fluoreszenzmikroskop der Modellreihe BZ-X ist mit fortschrittlichen Bildgebungs- und Analysefunktionen sowie einem vollmotorisierten Steuerungssystem ausgestattet. Es verfügt über eine integrierte Dunkelkammer und hat dabei nur den Platzbedarf eines DIN A3-Blattes. Die hochempfindliche, gekühlte CCD-Kamera kann für hochauflösende Betrachtungen ohne Fluoreszenzunschärfe zwischen Monochrom- und Farbaufnahmen umgeschaltet werden. Der große motorisierte Objekttisch lässt sich schnell zum gewünschten Betrachtungsort steuern und fokussiert dabei automatisch. Dank der Funktion zur Reproduktion der Aufnahmebedingungen lassen sich nutzerabhängige Abweichungen eliminieren. Zusätzlich zur automatischen Stapelaufnahme einer gesamten Multi-Well-Platte lassen sich Hellfeld-, Fluoreszenz- und Phasenkontrastaufnahmen im Zeitraffer durchführen. Verschiedene Analysefunktionen, wie dreidimensionale Analyse, Bewegungsanalyse und automatische Zeitrafferquantifizierung, stehen zur Verfügung.

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Fluoreszenzmikroskope betrachten Proben mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Methode zur Betrachtung und Erfassung von Fluoreszenz, bei der ein mit ultraviolettem oder sichtbarem Licht (Anregungslicht) bestrahltes Material eine bestimmte Wellenlänge des Lichts absorbiert und eine längere Wellenlänge emittiert.
Im Gegensatz zur Betrachtung bei der eine Probe mit sichtbarem Licht bestrahlt und das reflektierte Licht vergrößert wird, liegt der Fokus bei Fluoreszenzmikroskopen nur auf der von der Probe emittierten Fluoreszenz und die Betrachtung wird mit einem hochempfindlichen Detektor durchgeführt. Da die Fluoreszenz in einem dunklen Sichtfeld leuchtet, kann ein bestimmter Erkennungsbereich identifiziert werden, was eine Betrachtung und Erkennung mit hoher Auflösung ermöglicht.

Vorteile von Fluoreszenzmikroskopen

Fluoreszenzmikroskope beleuchten Zellen, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingefärbt wurden, und machen so die Eigenschaften der Zellen deutlich sichtbar. Fluoreszenzmikroskope sind ebenfalls hochempfindlich und können für eine detaillierte Betrachtung Helligkeits- und Wellenlängenunterschiede erkennen.

Für die Betrachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop werden Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff eingefärbt, um sie in hoher Auflösung und mit großer Kontrastklarheit zwischen verschiedenen benachbarten Regionen und Strukturen in der Zelle zu betrachten. Fluoreszenzmikroskope sind ebenfalls hochempfindlich und können Helligkeits- und Wellenlängenunterschiede für eine detaillierte Betrachtung von Zellen und Molekülen in den Zellen erkennen. Es können auch Aufnahmen für mehrere Fluoreszenzfarbstoffe erzeugt werden, indem man unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe und Bandpassfilter für die verschiedenen Spektren verwendet.

Fluoreszenzmikroskope können durch die Kombination einer weißen Lichtquelle mit einem Anregungsfilter eine Vielzahl von Zellen anregen. Die Verwendung eines hochempfindlichen Bildsensors ermöglicht die Fluoreszenzbetrachtung mit minimaler Beschädigung der Proben und erleichtert somit die Betrachtung lebender Zellen.

Einige Fluoreszenzmikroskope verwenden eine weiße Lichtquelle mit Wellenlängen von Ultraviolett bis Nahinfrarot und einen entsprechenden Anregungsfilter für das Fluoreszenzreagenz, um eine verlustfreie Abbildung der angeregten Fluoreszenz zu ermöglichen. Der hochempfindliche Bildsensor und die Funktionen zur Unterdrückung des Photobleachings verringern zudem die Gefahr einer Beschädigung der Proben. Dies ermöglicht eine einfache Zeitraffer- und Live-Bildgebung für eine hochauflösende Betrachtung lebender Zellen.

Fluoreszenzmikroskope mit elektronischem Projektionselement ermöglichen eine strukturierte Beleuchtung für eine schnelle Probenerfassung. Das Sectioning-Modul verwendet eine weiße Lichtquelle, um Photobleaching so gering wie möglich zu halten, und ermöglicht mit Optical Sectioning eine hochpräzise Bildgebung ohne Fluoreszenzunschärfen in einem breiten Wellenlängenbereich.

Bei dicken Proben können mit der bisher eingesetzten Fluoreszenzbildgebung nicht ohne weiteres scharfe Aufnahmen erstellt werden, da die Fluoreszenzunschärfe, welche durch unscharfes Streulicht in Z-Richtung verursacht wird, mit klaren Signalen von fokussierten Oberflächen vermischt wird.
Bei Fluoreszenzmikroskopen mit strukturierter Beleuchtung wird das Anregungslicht in einem strukurierten Streifenmuster auf die Probe projiziert. Die Streifen werden auf fokussierten Flächen deutlich projiziert, auf unscharfen Flächen werden sie jedoch nicht deutlich projiziert und können demnach nicht betrachtet werden. Durch die Bewegung des Streifenmusters wird die Probe gescannt und mehrere Aufnahmen werden automatisch erstellt. Die Helligkeit der Bereiche mit Fluoreszenzunschärfe ändert sich bei der Bewegung des Streifenmusters jedoch nicht signifikant, sodass nur die Bereiche mit Fluoreszenzunschärfe ausgeschlossen werden können. Somit können auch von dicken Proben scharfe Aufnahmen erstellt werden.
Eine Methode zur Strukturierung des Anregungslichts ist die Verwendung eines elektronischen Projektionselements. Das Muster lässt sich nicht nur entsprechend der Vergrößerung automatisch in der Breite anpassen, sondern ermöglicht durch die Umwandlung des Musters in eine Lochblendenform eine Bildgebung mit hoher Auflösung.

Anwendungsbereiche von Fluoreszenzmikroskopen

Krebsforschung in der Zellbiologie: Lokalisierte Betrachtung von Exosomen

Exosomen sind mit einem Durchmesser von 30 bis 150 nm sehr klein. Die Modellreihe BZ-X ermöglicht bei der Exosomenbetrachtung durch die Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs die Visualisierung der Exosomen, die Betrachtung der im extrahierten Exosom enthaltenen RNA-Ladung und der Exosomenmembran. Somit lassen sich zeitabhängige Veränderungen der Exosomenlokalisation und die Aufnahme von Exosomen in Zellen verfolgen (ein Prozess der interzellulären Kommunikation über Exosomen).
Mit der Modellreihe BZ-X können neben der hochpräzisen Analyse auch Betrachtungen von z.B. Exosomenveränderungen und dem entsprechenden Prozess durchgeführt werden.

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Klinische Medizin: Automatische Analyse des CD68 Glomerulus-Flächenverhältnisses

Das Eindringen von CD68 (Makrophage) in den Nierenglomerulus wird allgemein bei allen progressiven Nierenerkrankungen beobachtet. Die CD68-Betrachtung beinhaltet eine HE-Färbung mit anschließender Aufnahme einer Nierenbiopsie von oben.
Selbst bei dicken Proben ermöglicht die Z-Stapel-Bilderfassung mit der Modellreihe BZ-X, dass das gesamte Bild scharf abgebildet wird. Die schnelle Bildzusammensetzungsfunktion ermöglicht hochauflösende Aufnahmen von oben. Schwellenwerte können automatisch eingestellt werden, wodurch objektive Analysen möglich sind. Glomeruli – mikroskopisch kleine Kugeln aus Kapillaren – steuern die Filterfunktion der Niere. In einer einzelnen Niere gibt es etwa eine Million Glomeruli. Das Eindringen von CD68 in die Glomeruli führt zu einer Fibrose des Nierengewebes und zu einer progressiven Nierenerkrankung.

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Materialchemie: Visualisierung der Faserdispersion in Verbundwerkstoffen

Verbundwerkstoffe aus einer Verbindung von organischen und anorganischen Materialien haben möglicherweise nicht die gewünschten Eigenschaften, wenn sie während des Herstellungsprozesses nicht gleichmäßig gemischt werden. Bei der Überprüfung der richtigen Mischung von organischen und anorganischen Materialien leuchten organische Materialien in der Regel, anorganische Materialien jedoch nicht. Die Fluoreszenzbetrachtung nutzt diese Eigenschaft, um nur die organischen Materialien sichtbar zu machen und die Mischung aus organischen und anorganischen Materialien zu bestätigen.
Die Modellreihe BZ-X erfasst schnell kontinuierliche Fluoreszenz- und optische Hellfeldaufnahmen und erzeugt problemlos Overlays. Durch die Überlagerung von Hellfeld- und Fluoreszenzaufnahmen kann die Dispersion des organischen Materials deutlich untersucht werden, während die gesamte Form betrachtet wird. Die leuchtenden Bereiche können mithilfe quantitativer Analysesoftware sehr einfach in ein Binärbild umgewandelt werden. Diese Umwandlung ermöglicht darüber hinaus eine quantitative Bewertung anhand von Substanzanzahl, Fläche und anderen numerischen Parametern. Die Modellreihe BZ-X kann unabhängig von der Vergrößerung auch bei großen Proben Aufnahmen mit einem breiten Sichtfeld liefern und ermöglicht so eine genaue Analyse und Beurteilung.

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Quantitative Analyse mit Mikrotiterplatten

Der große motorisierte Objekttisch ermöglicht die Betrachtung einer breiten Auswahl an Proben. In Kombination mit den Funktionen Objekttischbetrachtung und Navigation zum schnellen Auffinden des gewünschten Bereichs ermöglicht der Objekttisch den Forschenden schnelle großflächige Betrachtungen, bei denen sie ihre Probe nie aus den Augen verlieren. Aufnahmeeinstellungen, die für einen benutzerdefinierten Punkt festgelegt wurden, können auch schnell auf alle Sichtfelder innerhalb mehrerer Wells angewendet werden. Dadurch werden alle Wells in der Platte unter den gleichen Bedingungen gescannt. Neben der zufälligen Bestimmung der Aufnahmeposition können auch nur benutzerdefinierte Sichtfelder und Wells gescannt werden.
Einheitliche Aufnahmeeinstellungen ermöglichen Aufnahmen mit hoher Reproduzierbarkeit. Die Einstellungen können einfach konfiguriert werden, sodass der Benutzer das Mikroskop nicht von Anfang bis Ende überwachen muss. Eine große Anzahl an Aufnahmen lässt sich automatisch analysieren, indem die Aufnahme- und Analyseeinstellungen an einer einzelnen Aufnahmen vorgenommen und auf alle weiteren Aufnahmen übertragen werden.
Die sehr detaillierten, mittels hochauflösender Aufnahmen des kompakten Fluoreszenzmikroskops gewonnenen Messdaten ermöglichen nicht nur eine genaue Analyse in kurzer Zeit und ohne Schwankungen, sondern liefern auch scharfe Betrachtungsergebnisse.

Erfassen von Veränderungen in lebenden Zellen und Geweben

Es ist möglich, erweiterte Zeitrafferaufnahmen von Hellfeld-, Fluoreszenz- und Phasenkontrastaufnahmen in vorher festgelegten Zeitabständen in chronologischer Reihenfolge aufzunehmen. Die integrierte Funktion „Helligkeitsmessung im zeitlichen Verlauf“ ermöglicht die Zeitrafferquantifizierung von Änderungen der RGB-Helligkeit in Zeitraffer-Aufnahmen und erlaubt damit quantitative Auswertungen im zeitlichen Verlauf für Experimente wie z. B. Änderungen in der Genexpression.
Die Aufnahmeposition kann auch während der Zeitrafferaufnahme angepasst werden (X, Y, Z), damit der interessierende Bereich innerhalb des Sichtfelds fokussiert bleibt. Dadurch wird die Position anhand der zuvor erstellten Aufnahmen angepasst, was Photobleaching und eine verminderte Zellaktivität durch die Einstrahlung von Anregungslicht verhindert. Die Verwendung eines Zeitraffermoduls (BZ-H4XT) und eines erweiterten Betrachtungsmoduls (BZ-H4XD) ermöglicht für jede registrierte Mehrpunkt-Koordinate die individuelle Konfiguration verschiedener Bedingungseinstellungen, wie etwa Fokusposition, Belichtungszeit, Objektivvergrößerung, verwendete Filter und Breite/Pitch des Z-Stapels. Eine Funktion, die automatisch die schärfste Aufnahme aus den Z-Stapel-Daten auswählt (Schärfenachführung), sorgt außerdem dafür, dass stets scharfe Aufnahmen erfasst werden.

Hochauflösende Erfassung eines breiten Sichtfeldes

Die gekühlte Schwarz-Weiß-CCD-Kamera liefert scharfe Aufnahmen mit hoher Empfindlichkeit und geringem Rauschen. Dies ermöglicht eine klare Fluoreszenzbildgebung auch bei schwachem Anregungslicht und reduziert sowohl das Photobleaching als auch Zellschäden durch Phototoxizität auf ein Minimum. Die Kamera kann auch Farbstoffe wie Cy7 im Nahinfrarotbereich abbilden und ermöglicht so die Betrachtung von Zellen in tiefen Gewebeschichten. Darüber hinaus wird hierbei eine Halogen-Metalldampflampe als Fluoreszenzlichtquelle für den breiten Wellenlängenbereich von UV bis IR verwendet. Dadurch wird eine Reihe von Fluoreszenzpigmenten ohne zusätzliche Lichtquelle unterstützt, einfach durch den Austausch von Filtern. Die Optical Sectioning-Technologie der Modellreihe BZ-X nutzt ein elektronisches Projektionselement zur strukturierten Beleuchtung für eine Bildaufnahme mit hoher Auflösung ohne Fluoreszenzunschärfe.
Durch die genaue Erkennung konfokaler Punkte können selbst von dicken Proben scharfe Aufnahmen erfasst werden. Diese Funktion ermöglicht die Erfassung unterschiedlicher Proben wie tierische Zellen, pflanzliche Zellen und kultiviertes Gewebe. Optical Sectioning liefert außerdem hochpräzise Querschnittsaufnahmen ohne Fluoreszenzunschärfe aus anderen Fokusebenen. Klare Z-Stapel können dann in realistische 3D-Renderings umgewandelt werden, die wiederum eine genaue Lokalisierungsanalyse ermöglichen.

Häufig gestellte Fragen zu Fluoreszenzmikroskopen

Obwohl beide Systeme die von fluoreszierenden Proteinen oder der Probe selbst emittierte Fluoreszenz (Autofluoreszenz) als Reaktion auf die Wellenlänge des eingestrahlten Lichts (Anregungslicht) zur Betrachtung nutzen, ist die Lichtquelle in einem Fluoreszenzmikroskop eine weiße Lichtquelle, während bei einem konfokalen Mikroskop ein Laser verwendet wird. Nachfolgend sind weitere wichtige Unterschiede zwischen diesen beiden Mikroskoptypen aufgeführt.

Fluoreszenzmikroskope:
• Zu den Lichtquellen gehören Quecksilberlampen (Ultrahochdruck-Quecksilberlampen, Halogen-Metalldampflampen usw.) und LEDs.
• In der Regel wird eine Fläche mit Licht bestrahlt und zur Betrachtung und Erfassung der angeregten Fluoreszenz wird ein Bildsensor verwendet.
• Die weiße Lichtquelle bietet einen breiten Wellenlängenbereich von Ultraviolett bis Nahinfrarot, um Fluoreszenz verschiedener Wellenlängen mit einer einzigen Lichtquelle zu erfassen. Dafür müssen entsprechende Filter verwendet werden.

Konfokale Mikroskope:
• Als Lichtquelle wird ein Laser verwendet.
• Der Laser wird punktförmig eingestrahlt und abgetastet. Die angeregte Fluoreszenz wird mithilfe eines Photomultipliers in Daten umgewandelt, um das Betrachtungsbild zu erzeugen.
• Unschärfen von außerhalb der Fokusebene können durch Platzierung einer Lochblende an einer zur Fokusebene konjugierten Position eliminiert werden.

Die meisten Objektive mit der gleichen Brennweite (60 mm) und einem M25-Gewindedurchmesser können ohne Weiteres verwendet werden. Mit Hilfe eines Adapters können auch andere Objektive verwendet werden. Wenden Sie sich an KEYENCE, um zu prüfen, ob ein bestimmtes Objektiv verwendet werden kann, oder um weitere Informationen zu Adaptern anzufordern.

Aufnahmen, die mit dem kompakten Fluoreszenzmikroskop BZ aufgenommen wurden, enthalten eingebettete Bildgebungsbedingungen wie Objektivvergrößerung, verwendete Filter, Koordinatenpositionen und Belichtungszeiten. Die Details der Aufnahmeeinstellungen gespeicherter Bilder werden mit einem Bildanalysemodul überprüft. Die Funktion zur Wiederherstellung von Aufnahmebedingungen kann auch verwendet werden, um schnell alle Aufnahmebedingungen als aktuelle Einstellungen zu übernehmen, einfach durch Anklicken einer Zielbilddatei. Das bedeutet, dass Bilder unter den vorherigen Aufnahmebedingungen schnell und genau erfasst werden können.

Mit dem kompakten Fluoreszenzmikroskop der Modellreihe BZ-X entfällt zunächst einmal die Notwendigkeit einer Dunkelkammer. Eine kontrastreiche Fluoreszenzbildgebung ist selbst in einem hell beleuchteten Raum möglich. Mit einer Stellfläche in der Größe eines DIN A3-Blattes kann das System fast überall installiert werden.
Trotz der kompakten Größe verfügt die Modellreihe BZ-X über einen großen motorisierten Objekttisch, der mit Mikrotiterplatten zur effizienten Betrachtung mehrerer Proben verwendet werden kann. Es können bis zu sechs Objektive montiert werden und die CCD-Kamera kann zwischen Farb- und Schwarz-/Weiß-Modus umschalten. Die meisten Einstellungen können am PC durchgeführt werden, vom Wechsel der Objektive und Filter bis hin zur Fokuseinstellung. Der Low-Photobleach-Modus und eine schnelle Autofokus-Funktion ermöglichen auch Neulingen, scharfe Aufnahmen zu erfassen.
Darüber hinaus bietet das System eine breite Palette erweiterter Funktionen zur Unterstützung einer Vielzahl von Proben, darunter eine Sectioning-Funktion für Optical Sectioning-Aufnahmen, eine Bildzusammensetzungsfunktion zum automatischen Zusammenfügen erfasster Bilder und eine hybride Zellzählungs-/Imaging-Zytometer-Funktion für die automatische quantitative Analyse. Neben der einfachen Installation und Bedienung machen diese Funktionen das kompakte Fluoreszenzmikroskop der Modellreihe BZ-X zu einem leistungsstarken System, das sehr vielseitig eingesetzt werden kann.

Vereinfacht ausgedrückt, bestehen Fluoreszenzmikroskope aus einer CCD-Kamera, die als Detektor dient, einem Filter, einer Lichtquelle und einem Strahlteiler. Der Filter besteht aus einem Anregungsfilter und einem Fluoreszenzfilter. Fluoreszenzmikroskope verwenden entweder die Transmissionsmethode mit einem Dunkelfeldkondensator, der das auf die Probe einstrahlende Anregungslicht vollständig vom optischen Betrachtungsweg abschneidet, oder die Auflichtmethode mit dichroitischen Spiegeln, die kurze Wellenlängen reflektieren und lange Wellenlängen durchlassen. Darüber hinaus werden Objektive aus Glas mit geringer Autofluoreszenz verwendet. Im folgenden Abschnitt werden die Komponenten eines Epifluoreszenzmikroskops erläutert.

CCD-Kamera (Detektor)

Die Kamera erkennt das ausgesendete Licht und ist mit einem Computerbildschirm verbunden, auf dem die erfasste Aufnahme angezeigt wird.

Lichtquelle

Als Lichtquelle werden Quecksilber (Hg)-, Xenon (Xe)-Lampen oder LEDs verwendet.

Anregungsfilter

Dieser Filter entzieht der Anregungslichtquelle nur Licht der Wellenlänge, die für die Anregung von fluoreszierenden Materialien erforderlich ist. Der Filter lässt nur bestimmte Wellenlängen durch und blockiert alle anderen Wellenlängen.

Strahlteiler (dichroitischer Spiegel)

Der Strahlteiler trennt das Anregungslicht von der Fluoreszenz. Im Gegensatz zu gewöhnlichen Spiegeln reflektiert dieser Spiegel nur Licht mit bestimmten Wellenlängen und filtert alles andere Licht heraus. Da das Anregungslicht von der Probe reflektiert wird, wird nur die von der Probe emittierte Fluoreszenz zur CCD-Kamera übertragen.

Fluoreszenzfilter

Der Fluoreszenzfilter blockiert alle Wellenlängen des Lichts außer der Wellenlänge des von der Probe emittierten Lichts. Auf diese Weise wird die von der Probe emittierte Fluoreszenz von allem anderen Licht, auch Streulicht, gefiltert.

A: Anregungsfilter, B: CCD-Kamera (Detektor), C: Fluoreszenzfilter, D: Strahlteiler (dichroitischer Spiegel), E: Objektiv, F: Probe, G: Lichtquelle

Fluoreszenzmikroskop-Filter

Funktionen der Filter

Der Anregungsfilter, der Strahlteiler und der Fluoreszenzfilter sind im Fluoreszenzmikroskop in einer einzelnen Spiegeleinheit, dem „Würfel“, untergebracht. Diese Einheit ist so konzipiert, dass sie dem Spektrum* eines bestimmten fluoreszierenden Materials entspricht. Einige Spiegeleinheiten enthalten jedoch keinen Filter. In solchen Mikroskopen wird der Filter auf einer Scheibe, dem sogenannten Filterwechsler, platziert. Dieser Filterwechsler wird verwendet, um die Anregungs- und Fluoreszenzwellenlängen optimal zu kombinieren.
Filter werden verwendet, um nur auf das gewünschte Licht zu fokussieren, das vom fluoreszierenden Material der Probe emittiert wird, und nicht auf das Licht von anderen Teilen des Systems (wie Umgebungslicht oder die Anregungslichtquelle). Unerwünschtes Licht, das den Detektor erreicht, wird als „Hintergrundfluoreszenz“ bezeichnet.

* Spektrum: Eine Anordnung von Lichtintensitätsverteilungen bei verschiedenen Wellenlängen, die durch das von einem Spektrometer zerlegte Licht erzeugt werden (Spektralbeugung).

Auswahl des Filters

Die Auswahl des Filters hängt davon ab, ob die Betrachtung mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen erfolgt. Wenn Sie z. B. nur einen Fluoreszenzfarbstoff betrachten möchten, wählen Sie einen geeigneten Anregungsfilter und Fluoreszenzfilter für diesen Farbstoff. Für die Betrachtung von zwei oder mehr Fluoreszenzfarbstoffen variiert die Kombination aus Anregungs- und Fluoreszenzfilter je nach den spezifischen Farbstoffen. Dies liegt daran, dass die jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe unterschiedliche Lichtspektren haben, sodass es für die Filterauswahl notwendig ist, das Spektrum für den Fluoreszenzfarbstoff zu kennen.

Bestimmung des Spektrums

Bei der Auswahl eines Filters ist es notwendig, zunächst für jeden Fluoreszenzfarbstoff sowohl das Anregungs- als auch das Fluoreszenzspektrum zu bestimmen. Bei der Verwendung von zwei Fluoreszenzfarbstoffen muss für einen der Farbstoffe ein Farbstofftrennfilter mit einem schmalen Transmissionsbereich eingesetzt werden, um die Anregung des anderen Farbstoffs zu unterdrücken. Andernfalls, wenn der Transmissionsbereich eines Filters den langwelligen Bereich umfasst, wird auch die Fluoreszenz des anderen Filters betrachtet.
Der Filter für den anderen Fluoreszenzfarbstoff muss ebenfalls dem gewünschten Spektrum entsprechen, um eine Betrachtung zu ermöglichen. Somit ermöglicht es die Anwendung von Filtern mit einem schmalen Transmissionsbereich, passend für die jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe, nur das Zielsignal zu betrachten.

Auswahl eines Anregungsfilters

Je nach Breite des Lichtwellenlängenbereichs sind breitbandige und schmalbandige Filter erhältlich. Der ausgewählte Filter sollte möglichst spezifisch auf die Anregungswellenlänge der fluoreszierenden Substanz passen. Insbesondere bei der Verwendung einer Quecksilberlampe als Lichtquelle ist für eine effiziente Anregung die Einbeziehung der Emissionslinien der Quecksilberlampe in die Anregungswellenlänge erforderlich. Im Allgemeinen führt die Verwendung eines starken Lichts in einem anderen Wellenlängenband als die Anregungswellenlänge des zu betrachtenden fluoreszierenden Materials zu mehr Rauschen und somit zu einer helleren Aufnahme. Da dies jedoch die Probe unnötig beschädigen kann, wird im Allgemeinen ein schmaler Bandpassfilter bevorzugt.

Auswahl eines Fluoreszenzfilters

Die Wahl des Fluoreszenzfilters ist abhängig von der Lichtquelle. Bei Verwendung einer weißen Lichtquelle müssen wegen des breiten Lichtbereiches nur die zur Anregung notwendigen Wellenlängen extrahiert werden, daher werden in der Regel optische Filter verwendet.
Optische Filter gibt es in einer Vielzahl von Ausführungen, von einfachen farbigen Glasfiltern bis hin zu Interferenzfiltern, die nur Licht bestimmter Wellenlängen durchlassen und alles andere Licht blockieren. Um nur Licht einer bestimmten Wellenlänge zu extrahieren, wird in der Regel ein Bypass-Filter verwendet, der nur einen schmalen Wellenlängenbereich durchlässt. Zur Betrachtung von nur einem Fluoreszenzfarbstoff wird entweder ein Langpassfilter oder ein Kurzpassfilter verwendet.

Langpass- und Kurzpassfilter
Langpass- und Kurzpassfilter werden bei der Betrachtung eines einzelnen Fluoreszenzfarbstoffs verwendet. Langpassfilter reduzieren das Hintergrundrauschen, indem sie das Anregungslicht blockieren und alles andere Licht durchlassen.
Kurzpassfilter hingegen lassen nur Wellenlängen durch, die kürzer als eine bestimmte Wellenlänge sind. Diese Filter werden häufig für die Betrachtung eines einzelnen Farbstoffs verwendet, da sie eine optimale Signalerkennung ermöglichen.

Bandpassfilter
Bandpassfilter werden verwendet, wenn mehr als ein Fluoreszenzfarbstoff in einer Probe verwendet wird. Das Licht von jedem Farbstoff wird getrennt, sodass der Detektor nur die von der Probe emittierte Fluoreszenz erkennt. Daher wird dieser Filter auch als Bandpass-Fluoreszenzfilter bezeichnet.

Zusammenfassung

Die Spiegeleinheit kann individuell zusammengestellt werden, indem die Filter und der Strahlteiler passend zur Lichtquelle erworben werden. Dies ermöglicht dem Anwender, die ideale Kombination von Spiegeleinheiten für den jeweils verwendeten Fluoreszenzfarbstoff zu erstellen.
Bei einem kompakten Fluoreszenzmikroskop hingegen sind die Spiegeleinheit, die Lichtquelle und die Objektive eingebaut. Dies bedeutet eine einfache Installation, vereinfachte Bedienung und eine zuverlässige Betrachtung auch für diejenigen, die mit der Bedienung eines Mikroskops nicht vertraut sind. Insgesamt kann man sagen, dass für eine zuverlässige Fluoreszenzbildgebung jedes Merkmal optimal genutzt werden muss.

Die Website „Mikroskopielabor“ von KEYENCE enthält Informationen für jeden Forscher, der Mikroskope verwendet. Sie verfügt über zahlreiche Anwendungsbeispiele, Informationen über Analysemethoden und Erfahrungsberichte über die Modellreihe BZ-X von Forschern aus verschiedenen Bereichen.

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