Lokalisierte Betrachtung von Exosomen

In den letzten Jahren hat man sich auf die extrazellulären Vesikel (EV) konzentriert, die nicht nur von Tumorzellen und Immunzellen, sondern von allen Zellen im Körper ausgeschieden werden. Extrazelluläre Vesikel kommen in den meisten Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit, und in Zellkulturen vor und sind kleine Membranvesikel mit einem Durchmesser von 30 bis 100 nm, die von Zellen ausgeschieden werden.
Extrazelluläre Vesikel werden eingeteilt in Exosomen, Mikrovesikel (MV) und apoptotische Körper entsprechend der unterschiedlichen Mechanismen, mit denen sie erzeugt werden. Lange Zeit glaubte man, dass die Exosomen an der Ausschüttung von irrelevantem Zellinhalt beteiligt sind. In den letzten Jahren sind die Exosomen jedoch in den Fokus gerückt, weil sich bestätigt hat, dass sie das Potenzial haben, die Pathologie verschiedener Krankheiten, wie bösartige, immunologische oder neurologische Erkrankungen und Infektionskrankheiten aufzuklären und diese zu behandeln.
Folgend werden grundlegende Kenntnisse über die Erzeugungsmechanismen und Funktionen von Exosomen sowie Beispiele für die Behandlung von Krankheiten und für die Betrachtung von Exosomen vorgestellt.

Was sind Exosomen?

Exosomen sind eine Art von extrazellulären Vesikeln. Zellen bringen extrazelluläres Material über einen als Endozytose bezeichneten Mechanismus in sie ein. Hierbei werden Vesikel, auch Endosomen genannt, gebildet. Die gebildeten Vesikel gehen von Clathrin-beschichteten Vesikeln über frühe Endosomen in späte Endosomen über. Wenn dann ein multivesikulärer Körper (MVB) - der viele intraluminale Membranvesikel (ILV) enthält - mit der Zellmembran fusioniert, werden Membranvesikel aus dem Endosom aus der Zelle ausgestoßen. Diese ausgestoßenen Endosomen sind Exosomen.
Exosomen enthalten verschiedene Proteine und Ribonukleinsäuren (RNA), die von der ausscheidenden Zelle stammen, wie z. B. Proteine, die von Endosomen und der Zellmembran stammen, und Proteine, die mit dem intrazellulären Transport zusammenhängen. Sie enthalten auch die Zellmembran der ausscheidenden Zelle und Fette, die von der Endosomenmembran stammen. Dieser Inhalt wird als Ladung bezeichnet. Diese Exosomen werden dann von anderen Zellen aufgenommen, wobei die im Exosom enthaltenen Proteine und RNA auf die neue Zelle übertragen werden.
Aufgrund dieser Vorgänge wird angenommen, dass die Exosomen eine Schlüsselrolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Daher wird die Erforschung von Exosomen, insbesondere im medizinischen Bereich, weiter fortgeführt.

Erkennung und Analyse von Exosomen

Es gibt zwei Hauptmethoden zur Analyse von Exosomen. Eine Methode ist die Extraktion von Exosomen aus Körperflüssigkeiten oder Zellkulturen und anschließend die Analyse der von den Exosomen transportierten Proteine, Fette und RNA. Die andere Methode ist der direkte Nachweis und die Analyse von Exosomen aus Körperflüssigkeiten. Darüber hinaus wird bei der Betrachtung und Analyse ein Fluoreszenzmikroskop eingesetzt, um Partikel zurückzuverfolgen, die in Zellen aufgenommen und aus Zellen ausgeschieden werden.

Verfahren unter Verwendung von Körperflüssigkeiten oder Zellkulturen

Im Allgemeinen werden Methoden wie Ultrazentrifugation und Ultrafiltration eingesetzt, um Exosomen aus Proben von Körperflüssigkeiten wie Blut und Aszitesflüssigkeit zu trennen und aufzureinigen. Es ist jedoch schwierig, mit diesen Methoden nur die Exosomen zu analysieren, da die Probe auch andere Elemente, wie z. B. Partikel mit ähnlichen Eigenschaften und Konzentrationen sowie hochmolekulare Proteine enthält.
Daher wird diese Methode manchmal in Kombination mit einer Affinitätschromatographie durchgeführt.*1 Außerdem werden Größenbestätigung und Western Blot*2 in der abschließenden Phase mit dynamischer Lichtstreuung und einem Mikroskop durchgeführt, um zu überprüfen, ob es sich bei der getrennten und gereinigten Probe tatsächlich um eine Gruppe von Exosomen handelt.

*1: Affinitätschromatographie
Hierbei handelt es sich um eine Methode zur Trennung und Reinigung des Zielmoleküls, -proteins oder -komplexkörpers durch Nutzung der Reaktion zwischen dem Zielmolekül und einem Molekül (Ligand), das sich auf spezifische und reversible Weise mit ihm verbindet.
*2: Western Blot (WB)
Dies ist eine grundlegende experimentelle Methode zur Bestimmung der Eigenschaften von Proteinen. Diese Technik eignet sich zur Messung von Proteinen, die als Exosomen erscheinen.

Verfahren zur direkten Extraktion und Analyse aus Körperflüssigkeiten

Die Verfahren Durchflusszytometrie,*3 Microarray-Analyse und Oberflächen-Plasmon-Resonanz werden als Methoden zum Nachweis von Exosomen aus Körperflüssigkeiten, ohne die Exosomen trennen oder reinigen zu müssen, erforscht. Eine weitere, als ExoScreen bezeichnete Methode, die für die Diagnose von Dickdarmkrebs entwickelt wurde, steht ebenfalls zur Verfügung. Diese vier Methoden werden hauptsächlich bei der Behandlung von Krebs eingesetzt.
Anders als bei der Biopsie, bei der ein normales Endoskop oder eine Nadel zur Entnahme von Tumorgewebe verwendet wird, ergeben sich bei der Flüssigkeitsbiopsie hohe Erwartungen an die Früherkennung von Krankheiten. Bei der Flüssigkeitsbiopsie werden Diagnosen und Vorhersagen über die Wirksamkeit von Behandlungen anhand einer Blutprobe oder anhand anderer Körperflüssigkeiten durchgeführt.

*3: Durchflusszytometrie
Hierbei handelt es sich um eine Methode zur Bewertung von Partikeleigenschaften unter Verwendung des Streulichts oder Fluoreszenzlichts, das man erhält, wenn eine Zelle oder ein winziger Partikel mit einem Laserstrahl bestrahlt wird. Sie kann verwendet werden, um sehr schnell mehrere Merkmale einer einzelnen Zelle gleichzeitig zu messen. Sie eignet sich zur Beurteilung des Expressionsniveaus von Exosomenproteinen und zur Beurteilung der Aufnahme von Exosomen in Zellen. Es ist schwierig, feste Mengen und den Vesikeltyp zu klassifizieren - diese Methode ist jedoch die einfachste Art, das Verhalten zu beobachten, mit dem die Exosomen in die Zellen aufgenommen werden.

Betrachtung und Analyse mit einem Fluoreszenzmikroskop

Bei der Exosomenbetrachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop können Exosomen mittels Fluoreszenzmarkierung sichtbar gemacht und rückverfolgt werden. Die im extrahierten Exosom enthaltene RNA-Ladung oder die Exosomenmembran wird durch Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht und auf diese Weise betrachtet.
Diese Betrachtung ermöglicht die Überwachung von zeitabhängigen Ortsveränderungen von Exosomen und von Exosomen, die in Zellen aufgenommen werden. Mit Fluoreszenzmikroskopen können Betrachtungen, z. B. von Exosomenveränderungen, durchgeführt werden, die mit anderen Methoden nicht möglich sind. Deshalb gelten Fluoreszenzmikroskope als eine neue Technologie, die Analysen mit höherer Genauigkeit ermöglicht.

Anwendung von Exosomen zur Behandlung von Krankheiten

Die Präzisierung der Funktion von Exosomen hat zu einer Zunahme der Forschungsaktivitäten im Bereich der Behandlungs- und Diagnosemethoden geführt, die diese Funktion für endokrine Drüsen und Organe des Kreislaufsystems anwenden. Beispiele hierfür sind die Früherkennung von Krebs und die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten wie Alzheimer-Demenz, Parkinson-Krankheit, spinozerebelläre Degeneration, Huntington-Krankheit und amyotrophe Lateralsklerose (ALS).

Früherkennung von Krebs

Es wird vermutet, dass Exosomen an Faktoren wie der Existenz, dem bösartigen Fortschreiten und der Ausbreitung von Krebszellen beteiligt sind. Die von den Krebszellen der Krebspatienten ausgestoßenen Exosomen enthalten verschiedene von den Krebszellen stammende Proteine und bewirken die Aktivierung der für Krebszellen charakteristischen zytotoxischen T-Zellen. Der Grund dafür ist, dass Exosomen, die aus Krebszellen stammen, Krebsgene enthalten. Folglich kann die Betrachtung der von Zellen ausgestoßenen Exosomen bei Krebspatienten zur Früherkennung von Krebs führen.
Bei krebsdiagnostischen Verfahren, bei denen die Eigenschaft der Exosomen, Informationen von einer Zelle zur anderen zu übertragen, im Vordergrund steht, ist die Früherkennung von Krebs mittels Flüssigkeitsbiopsie möglich. Bei der Krebsdiagnose mittels Flüssigkeitsbiopsie geht man davon aus, dass die Früherkennung von Krebs durch eine Untersuchung der Exosomen abnormaler Zellen möglich ist, weil der Inhalt der Exosomen die Eigenschaften der ausstoßenden Zellen zeigt.

Behandlung der Alzheimer-Demenz

Die Alzheimer-Demenz ist eine Art von kognitiver Beeinträchtigung, die durch die Atrophie des Gehirns aufgrund des Absterbens von Nervenzellen verursacht wird, das wiederum von Schäden durch die Toxizität von Amyloid-beta hervorgerufen wird. Auch bei der Behandlung der Alzheimer-Demenz geht man davon aus, dass die Endosomen einen großen Einfluss auf die Zunahme oder Abnahme des Amyloid-beta- und Tau-Proteins*4 haben, also der Substanzen, die die Krankheit verursachen.
Darüber hinaus wird an Methoden geforscht, die Partikel wie z. B. Medikamente und Nukleinsäuren in Exosomen in einem Drug Delivery System (DDS) einschließen, welches das Medikament effizient und sicher an das spezifische erkrankte Gewebe und die erkrankten Zellen abgibt.

*4: Tau-Protein
Das Tau-Protein existiert in den Nervenzellen des zentralen und des peripheren Nervensystems. Es verbindet sich mit verschiedenen Proteinen und steht im Zusammenhang mit verschiedenen Phänomenen, die im zentralen Nervensystem stattfinden, wie beispielsweise die Reifung des postnatalen Gehirns und die neuronale Entwicklung erwachsener Organismen. Es wird vermutet, dass Anomalien im Tau-Protein neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Demenz verursachen.

Diagnose mit Flüssigkeitsbiopsie

Die Flüssigkeitsbiopsie ist eine Methode mit minimalen Auswirkungen auf den menschlichen Körper, denn diese Methode verwendet Körperflüssigkeiten. Dabei handelt es sich um minimal-invasive Flüssigkeitsproben, wie Blut und Urin, und ist vor allem bei der Krebsdiagnose nützlich.
Flüssige Biopsieproben enthalten Tumore verschiedene Gewebe und von Zellen stammende Informationen. Durch die Betrachtung solcher Proben kann das Tumorprofil des gesamten Körpers betrachtet werden.
Bei der Biopsiemethode, bei der eine Probe mit einem normalen Endoskop oder einer Nadel entnommen wird, kann nur ein kleiner Teil des Tumorgewebes entnommen werden, ganz abgesehen von den Schmerzen und dem Komplikationsrisiko des Patienten. Daher war es mit dieser Methode bisher nur möglich, bruchstückhafte Profilinformationen zu erkennen.
Bei einer Flüssigkeitsbiopsie ist die Untersuchung nur mit Körperflüssigkeit möglich, sodass Krebsgendiagnosen und Vorhersagen zur Wirksamkeit der Behandlung ohne Auswirkungen auf den Körper durchgeführt werden können.

Was ist ein Drug Delivery System (DDS)?

Ein Drug Delivery System ist eine Behandlungsmethode, die die Eigenschaft von Exosomen, Material, wie Proteine, Nukleinsäure und Fette, von einer Zelle zu einer bestimmten anderen Zelle zu transportieren, nutzt.
In der Vergangenheit gab es Beispiele dafür, dass die krebsbekämpfende Wirkung in Brustkrebszellen bestätigt wurde und die in Neuroblastomzellen enthaltene Menge der Amyloid-beta-Substanz, welche die Alzheimer-Demenz verursacht, mit dieser Behandlungsmethode reduziert werden konnte.
Da es sich bei den Exosomen um Biomoleküle handelt, ist anzunehmen, dass die Behandlung mittels DDS weniger toxisch ist als die bisherige medizinische Transportmethode mit Nanopartikeln. Auch weil sich bestätigt hat, dass ein DDS Medikamente in Gewebe übertragen kann, die mit bisherigen Methoden nur schwer zu erreichen sind, bestehen bei dieser Methode große Hoffnungen auf ein leistungsstarkes Transportmolekül.

Zukünftiges Potential der Exosomenforschung

Exosomen haben, da sie Informationen zwischen Zellen übertragen, die negative Eigenschaft, auch Krankheiten zu übertragen. Im Zuge der Weiterentwicklung der medizinischen Wissenschaft und der Technologie zur Betrachtung der Vorgänge in den Zellen ist jedoch diese Eigenschaft genau der Punkt, weshalb sich Forscher auf die Exosomen konzentrieren, nämlich als Geheimwaffe, die eine fortschrittliche Behandlung mit Prävention, Früherkennung und direkter Verabreichung von Medikamenten an Zellen ermöglichen kann.
Darüber hinaus werden Exosomen auch aus den Zellen von Gemüse und Obst ausgeschieden. Ingwer hat zum Beispiel die Wirkung, alkoholinduzierte Leberschäden zu supprimieren, aber man nimmt an, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass die aus Ingwer gewonnenen Exosomen die Leber vor Schäden schützen. Es gibt auch Berichte über Forschungsergebnisse, die zeigen, dass die Exosomen gekochter Eier die Arterienverkalkung unterbinden und das Gedächtnis verbessern.
In der östlichen Medizin ist die Ernährung die Basis jeder medizinischen Behandlung, und man glaubt, dass die Basis der Medizin zur Heilung von Krankheiten und die Basis der Ernährung zur Förderung der Gesundheit, im Wesentlichen die gleiche ist. Aus dieser Betrachtungsweise heraus kann man sagen, dass die Exosomenforschung durch ihr breites Spektrum an Möglichkeiten für medizinische Behandlungen und die Ernährung die moderne Version des Prinzips ist, dass eine ausgewogene Ernährung zu einem gesunden Körper führt.

Einfache Überprüfung der 3D-Lokalisierung

Die einzigartige optische Sectioning-Technologie des kompakten Fluoreszenzmikroskops BZ-X800 nutzt ein elektronisches Projektionselement zur strukturierten Beleuchtung, um klare Bilder ohne Fluoreszenzunschärfe zu erreichen. Sowohl die Lokalisierung als auch Veränderungen über die Zeit werden deutlich angezeigt.
Im folgenden Beispiel wird die Sectioning-Funktion des BZ-X800 verwendet, um die Lokalisierung von Exosomen innerhalb einer menschlichen Epidermiszelle zu betrachten.
Mit dem BZ-X800 ist es möglich, mit hochauflösenden Bildern die Bewegung der von einer Zelle erzeugten Exosomen in andere Zellen zu betrachten.

Grün: Exosom, rot: Zellmembran
Bilderfassung mit XYZ-Schnitten
Objektiv: Plan Apo 100x
Exosom: grün (PKH67), Zellmembran: rot (CellMaskTM orange), Zellkern: blau (DAPI)

Verwendung des kompakten Fluoreszenzmikroskops BZ-X800