Lebendzell-Bildgebung: Ursachen für Fehlschläge sowie Gegenmaßnahmen

Die Anzahl der Forscher, die Zeitraffer- bzw. Lebendzell-Bildgebungen durchführen, ist in den letzten Jahren gestiegen. Um das zelluläre Verhalten besser verstehen zu können, bieten interaktive Zellexperimente einen genaueren Einblick als die Betrachtung fixierter Proben. Viele Forscher haben Schwierigkeiten bei der Betrachtung lebender Zellen. Uns erreichen häufig Berichte über Probleme, wie misslungene Betrachtungen und zeitraubende Experimente.

In diesem Abschnitt werden die drei häufigsten Gründe für Fehlschläge gemeinsam mit empfohlenen Gegenmaßnahmen erläutert, um die Erfolgsraten von Zeitrafferaufnahmen und Lebendzell-Bildgebungen zu verbessern.

Ursache Nr. 1: Die Zelle ist beschädigt.

Während des gesamten Zeitraffer-Experiments scheinen die Zellen immobil, tot oder anderweitig beschädigt zu sein. Dieses Problem kann mehrere Ursachen haben:

Die Zellen wurden durch Phototoxizität beschädigt.

Während der Fluoreszenzbetrachtung können Zellen, die über einen längeren Zeitraum starkem Anregungslicht ausgesetzt wurden, beschädigt werden. Dies wird auch als Phototoxizität*1 bezeichnet, die Zellen nicht nur schwächen oder abtöten, sondern sie auch in unerwarteter Weise beeinflussen kann.

Gegenmaßnahmen

  1. *1 Phototoxizität: Damit wird für gewöhnlich der Schaden bezeichnet, der durch das Anregungslicht verursacht wird. Der Begriff bezieht sich aber auch auf ein Phänomen, bei dem eine Zelle, die Fluoreszenz ausgesetzt ist, reaktiven Sauerstoff erzeugt, welcher wiederum die umliegenden Zellen beschädigt.
  2. *2 Gain: Dies ist eine Funktion, die das von der Kamera empfangene Signal elektrisch verstärkt. Je höher die Verstärkung, desto heller ist die Anzeige. Die Anzahl der Pixel bleibt unverändert, aber das Rauschen wird ebenfalls verstärkt.
  3. *3 Binning: Mit dieser Funktion werden umliegende Pixel virtuell zusammenfügt, um das empfangene Lichtsignal pro Einheit zu verstärken. Es wird weniger Rauschen erzeugt als bei einer höheren Verstärkung, aber die Anzahl der Pixel wird verringert.

Es wird keine geeignete Umgebung aufrechterhalten.

Die Mehrzahl der Zellen bevorzugen eine Umgebung, die normale physiologische Bedingungen nachstellt. Menschliche Zellen beispielsweise benötigen eine Temperatur von 37°C, eine Kohlendioxidkonzentration von 5% und eine Luftfeuchtigkeit von 95% oder höher in der Kammer oder im Inkubator, in der bzw. dem sie kultiviert werden. Wenn diese Umgebung nicht bereitgestellt und gepflegt wird, kann sich die Zellkultur rasch verschlechtern und es wird schwierig sein, genaue Daten zu erhalten.

Gegenmaßnahmen

Verunreinigung innerhalb der Probe.

Manche Zellen sind anfällig für Keime und Verunreinigungen, die sich auf dem Probenbehälter befinden. Zudem können Mykoplasmen-*4 und Kreuzkontamination*5 können durch die verwendete Pipette und anderes Equipment verursacht werden.

Gegenmaßnahmen
  1. *4 Mykoplasma-Kontamination: Hierbei handelt es sich um eines der häufigsten Phänomene, das eine Verunreinigung des Zellstamms durch Mykoplasma verursacht.
  2. *5 Kreuzkontamination: Dies bezieht sich auf das fehlerhafte Vermischen der beobachteten Zellkultur mit anderen Zellen. Meistens werden die Fremdzellen durch verwendetes Equipment übertragen.

Ursache Nr. 2: Die Zelle gerät aus dem Fokus.

Ein weiterer häufiger Misserfolg beruht darauf, dass die Probe durch das Experiment aus dem Fokus gerät. Dafür kann es mehrere Gründe geben:

Der Temperaturdrift*7 bewirkt eine Bewegung der Zelle oder eine Änderung der Einstellungen am Gerät.

Wenn Sie die Bildaufnahmeeinstellungen unmittelbar nach dem Einschalten des Geräts konfigurieren, kann sich die Fokusposition während der Konfiguration der Einstellungen verschieben. Der Grund dafür ist, dass für eine gewisse Zeit nach dem Einschalten des Geräts die Kulturflüssigkeit innerhalb des Behälters durch Konvektion zirkuliert wird, wodurch die Zellen bewegt werden. Ein weiterer Grund für die Unschärfe des Bildes ist, dass sich das Gerät aufgrund von Temperaturänderungen leicht ausdehnt. Achten Sie bei der Betrachtung von schwebenden oder adhärenten Zellen auf die Temperaturdrift zwischen dem Zeitpunkt der Konfigurationseinstellungen und dem der tatsächlichen Bildaufnahme.

Gegenmaßnahmen
  1. *7 Temperaturdrift: Ein Phänomen, bei dem Temperaturschwankungen Bewegungen der suspendierten Zelle bewirken oder die Ausdehnung des Systems selbst die Fokusposition verlagert.

Veränderungen in der Zellmorphologie

Lebende Zellen bewegen sich, insbesondere während der Zellteilung, in Z-Richtung auf und ab. Infolgedessen verliert ein Bild an Schärfe, wenn Sie zum Zeitpunkt der Zellteilung eine einmalige Bildaufnahme bei hoher Vergrößerung durchführen.

Gegenmaßnahmen

Mit den oben genannten Gegenmaßnahmen können Sie gezielt Fehler, die durch ein unscharfes Bild verursacht werden, bei der Lebendzell-Bildgebung verhindern. In dieser Situation stellen Sie den Autofokus und den Z-Stapel-Einstellbereich*9 auf nur einen Bereich ein. Dieser sollte nur so groß wie nötig sein, damit die Probe dem Anregungslicht nicht zu lang ausgesetzt wird.

  1. *8 Tiefenschärfe: Dies bezeichnet den Bereich, in dem das Bild scharf ist. Generell kann gesagt werden, je größer der NA-Wert, desto geringer die Tiefenschärfe.
  2. *9 Z-Stapel-Einstellbereich: Z-Stapel ist eine Funktion, die mehrere Abbildungen von Daten an verschiedenen Z-Positionen erfasst. Sie erhalten mehr Informationen, indem Sie Bilder über einen breiten Bereich und mit hoher Detailgenauigkeit erfassen. Dies erhöht jedoch auch die Schäden an der Zelle, sodass es besser ist, die Anzahl der erfassten Bilder so gering wie möglich zu halten.

Ursache Nr. 3: Die Zelle verlässt den Betrachtungs- und Messbereich.

Häufig verlassen die Zellen im Zuge des Experiments den Betrachtungs- und Messbereich. Wenn sich die Zelle aus dem Sichtfeld bewegt, bevor die Probenbetrachtung abgeschlossen ist, muss das gesamte Experiment wiederholt werden.

Ursache: Die Zelle bewegt sich.

Je länger das Experiment dauert, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Zelle aus dem Sichtfeld herausbewegt. Dagegen kann nichts unternommen werden, solange die Zelle lebendig ist. In einer Vielzahl von Arbeiten sind Daten vorhanden, die detaillierte Zellbedingungen zeigen. In vielen Fällen werden solche Daten durch wiederholte Bildaufnahmen bei hohen Vergrößerungen gewonnen, was mit einem hohen Arbeits- und Zeitaufwand verbunden ist.

Um Fehler zuverlässig zu verhindern, müssen Bilder von mehreren Stellen gleichzeitig erfasst oder sich bewegende Zellen während der Aufnahme verfolgt werden.

Gegenmaßnahmen

Sie können die Zellen präzise erfassen, indem Sie einen breiten Betrachtungs- und Messbereich mit geringer Vergrößerung beobachten. Die Details einer Zelle können jedoch mit einer geringen Vergrößerung nur schwer beobachtet werden. Je länger die Belichtungszeit, desto größer wird die Wahrscheinlichkeit, dass das Bild während der Bilderfassung unscharf wird.*10

  1. *10 Belichtungszeit und Bildunschärfe: Wenn Sie die Intensität des Anregungslichts verringern, muss länger belichtet werden. Wenn sich die Zelle bewegt, während die Verschlussblende geöffnet ist, wird das Bild unscharf. Der einfachste Weg, dieses Problem zu vermeiden, ist die Verwendung einer Kamera mit hoher Empfindlichkeit.

Zeitrafferexperimente mit 99 unterschiedlichen Positionspunkten

Bisher war es zur Erreichung besserer Forschungsergebnisse notwendig, Experimente zu wiederholen, um mehr Daten zu erhalten. Bei der Zeitrafferaufnahme nimmt jedoch ein einzelnes Experiment viel Zeit in Anspruch, sodass die Wiederholung von Experimenten umso zeitaufwändiger ist. Im Idealfall sollte ein einziges Experiment mehr Daten liefern.

Das kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 von KEYENCE löst dieses Problem mit der Zeitrafferaufnahmefunktion, indem eine vollautomatisierte Mehrpunkt-Bildaufnahme im Zeitverlauf erfasst wird. Es können bis zu 99 Punkte pro Experiment gleichzeitig unter völlig unterschiedlichen Bedingungen, wie z. B. Vergrößerungen von 2x, 4x oder 20x, gespeichert werden. Die Modellreihe BZ-X800 lässt sich einfach konfigurieren und verringert somit den Zeitaufwand, der üblicherweise für die Einrichtung des Systems und die Einarbeitung der Benutzer benötigt wird.