Lebendzell-Bildgebung: Ursachen für Fehlschläge sowie Gegenmaßnahmen
Die Anzahl der Forscher, die Zeitraffer- bzw. Lebendzell-Bildgebungen durchführen, ist in den letzten Jahren gestiegen. Um das zelluläre Verhalten besser verstehen zu können, bieten interaktive Zellexperimente einen genaueren Einblick als die Betrachtung fixierter Proben. Viele Forscher haben Schwierigkeiten bei der Betrachtung lebender Zellen. Uns erreichen häufig Berichte über Probleme, wie misslungene Betrachtungen und zeitraubende Experimente.
In diesem Abschnitt werden die drei häufigsten Gründe für Fehlschläge gemeinsam mit empfohlenen Gegenmaßnahmen erläutert, um die Erfolgsraten von Zeitrafferaufnahmen und Lebendzell-Bildgebungen zu verbessern.
- Häufige Fehler bei der Bilderfassung von lebenden Zellen, Ursache 1: Die Zelle ist beschädigt
- Häufige Fehler bei der Bilderfassung von lebenden Zellen, Ursache 2: Die Zelle gerät aus dem Fokus
- Häufige Fehler bei der Bilderfassung von lebenden Zellen, Ursache 3: Die Zelle verlässt den Betrachtungs- und Messbereich
- Gesteigerte Effizienz von Zeitrafferexperimenten
Häufige Fehler bei der Bilderfassung von lebenden Zellen
Ursache 1: Die Zelle ist beschädigt
Während des gesamten Zeitraffer-Experiments scheinen die Zellen immobil, tot oder anderweitig beschädigt zu sein. Dieses Problem kann mehrere Ursachen haben:
Die Zellen wurden durch Phototoxizität beschädigt
Während der Fluoreszenzbetrachtung können Zellen, die über einen längeren Zeitraum starkem Anregungslicht ausgesetzt wurden, beschädigt werden. Dies wird auch als Phototoxizität*1 bezeichnet, die Zellen nicht nur schwächen oder abtöten, sondern sie auch in unerwarteter Weise beeinflussen kann.
Gegenmaßnahmen
- Verwenden Sie eine hochempfindliche Kamera.
- Verwendung von Gain*2 und Binning*3, sodass selbst schwache Fluoreszenzsignale erkannt werden können.
- Reduzieren Sie die Intensität des Anregungslichts so weit wie möglich.
- Bei der Einstellung der Bildaufnahme sollte die Zelle so wenig Anregungslicht wie möglich ausgesetzt werden.
- Erfassen Sie nur so viele Bilder wie nötig.
- Schalten Sie das Anregungslicht aus, wenn Sie keine Bilder erfassen.
- *1 Phototoxizität: Damit wird für gewöhnlich der Schaden bezeichnet, der durch das Anregungslicht verursacht wird. Der Begriff bezieht sich aber auch auf ein Phänomen, bei dem eine Zelle, die Fluoreszenz ausgesetzt ist, reaktiven Sauerstoff erzeugt, welcher wiederum die umliegenden Zellen beschädigt.
- *2 Gain: Dies ist eine Funktion, die das von der Kamera empfangene Signal elektrisch verstärkt. Je höher die Verstärkung, desto heller ist die Anzeige. Die Anzahl der Pixel bleibt unverändert, aber das Rauschen wird ebenfalls verstärkt.
- *3 Binning: Mit dieser Funktion werden umliegende Pixel virtuell zusammenfügt, um das empfangene Lichtsignal pro Einheit zu verstärken. Es wird weniger Rauschen erzeugt als bei einer höheren Verstärkung, aber die Anzahl der Pixel wird verringert.
Es wird keine geeignete Umgebung aufrechterhalten
Die Mehrzahl der Zellen bevorzugen eine Umgebung, die normale physiologische Bedingungen nachstellt. Menschliche Zellen beispielsweise benötigen eine Temperatur von 37°C, eine Kohlendioxidkonzentration von 5% und eine Luftfeuchtigkeit von 95% oder höher in der Kammer oder im Inkubator, in der bzw. dem sie kultiviert werden. Wenn diese Umgebung nicht bereitgestellt und gepflegt wird, kann sich die Zellkultur rasch verschlechtern und es wird schwierig sein, genaue Daten zu erhalten.
Gegenmaßnahmen
- Verwenden Sie eine Kammer, die stabile Umgebungsbedingungen mit der geeigneten Temperatur, Kohlendioxidkonzentration und Feuchtigkeit bieten kann.
- Verwenden Sie Klimaanlagen und andere Geräte in Zeiten, in denen die Raumtemperatur stark schwankt, um sie zu stabilisieren.
- Achten Sie darauf, dass die von Klimaanlagen ausgeblasene Luft nicht direkt auf die Probe trifft.
- Stellen Sie sicher, dass die Mikrotiterplatten angemessen abgedeckt sind, um eine Wasserverdunstung zu verhindern.
Verunreinigung innerhalb der Probe
Manche Zellen sind anfällig für Keime und Verunreinigungen, die sich auf dem Probenbehälter befinden. Zudem können Mykoplasmen-*4 und Kreuzkontamination*5 können durch die verwendete Pipette und anderes Equipment verursacht werden.
- Gegenmaßnahmen
-
- Achten Sie bei der Durchführung des Experiments auf die Sterilisation von Behältern, Pipetten und andere Peripheriegeräten.
- Vermeiden Sie unnötige Störungen der Zellkultur.
- *4 Mykoplasma-Kontamination: Hierbei handelt es sich um eines der häufigsten Phänomene, das eine Verunreinigung des Zellstamms durch Mykoplasma verursacht.
- *5 Kreuzkontamination: Dies bezieht sich auf das fehlerhafte Vermischen der beobachteten Zellkultur mit anderen Zellen. Meistens werden die Fremdzellen durch verwendetes Equipment übertragen.
- Fluoreszenzmikroskope für eine erfolgreiche Lebendzell-Bildgebung
- Informieren Sie sich in unserem Katalog über das neue kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 von KEYENCE.
Häufige Fehler bei der Bilderfassung von lebenden Zellen
Ursache 2: Die Zelle gerät aus dem Fokus
Ein weiterer häufiger Misserfolg beruht darauf, dass die Probe durch das Experiment aus dem Fokus gerät. Dafür kann es mehrere Gründe geben:
Der Temperaturdrift*7 bewirkt eine Bewegung der Zelle oder eine Änderung der Einstellungen am Gerät
Wenn Sie die Bildaufnahmeeinstellungen unmittelbar nach dem Einschalten des Geräts konfigurieren, kann sich die Fokusposition während der Konfiguration der Einstellungen verschieben. Der Grund dafür ist, dass für eine gewisse Zeit nach dem Einschalten des Geräts die Kulturflüssigkeit innerhalb des Behälters durch Konvektion zirkuliert wird, wodurch die Zellen bewegt werden. Ein weiterer Grund für die Unschärfe des Bildes ist, dass sich das Gerät aufgrund von Temperaturänderungen leicht ausdehnt. Achten Sie bei der Betrachtung von schwebenden oder adhärenten Zellen auf die Temperaturdrift zwischen dem Zeitpunkt der Konfigurationseinstellungen und dem der tatsächlichen Bildaufnahme.
- Gegenmaßnahmen
-
- Wärmen Sie das Gerät 30 Minuten lang mit einem leeren Behälter auf, bevor Sie die Probe einsetzen.
- Warten Sie nach Platzieren der Probe weitere 30 bis 60 Minuten, bevor Sie Ihre gewünschte Fokusebene einstellen.
- *7 Temperaturdrift: Ein Phänomen, bei dem Temperaturschwankungen Bewegungen der suspendierten Zelle bewirken oder die Ausdehnung des Systems selbst die Fokusposition verlagert.
Veränderungen in der Zellmorphologie
Lebende Zellen bewegen sich, insbesondere während der Zellteilung, in Z-Richtung auf und ab. Infolgedessen verliert ein Bild an Schärfe, wenn Sie zum Zeitpunkt der Zellteilung eine einmalige Bildaufnahme bei hoher Vergrößerung durchführen.
Gegenmaßnahmen
- Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung und hoher Tiefenschärfe.*8
- Verwenden Sie für hohe Vergrößerungen die Autofokus-Funktion oder die Z-Stapel-Funktion.
Mit den oben genannten Gegenmaßnahmen können Sie gezielt Fehler, die durch ein unscharfes Bild verursacht werden, bei der Lebendzell-Bildgebung verhindern. In dieser Situation stellen Sie den Autofokus und den Z-Stapel-Einstellbereich*9 auf nur einen Bereich ein. Dieser sollte nur so groß wie nötig sein, damit die Probe dem Anregungslicht nicht zu lang ausgesetzt wird.
- *8 Tiefenschärfe: Dies bezeichnet den Bereich, in dem das Bild scharf ist. Generell kann gesagt werden, je größer der NA-Wert, desto geringer die Tiefenschärfe.
- *9 Z-Stapel-Einstellbereich: Z-Stapel ist eine Funktion, die mehrere Abbildungen von Daten an verschiedenen Z-Positionen erfasst. Sie erhalten mehr Informationen, indem Sie Bilder über einen breiten Bereich und mit hoher Detailgenauigkeit erfassen. Dies erhöht jedoch auch die Schäden an der Zelle, sodass es besser ist, die Anzahl der erfassten Bilder so gering wie möglich zu halten.
- Fluoreszenzmikroskope für eine erfolgreiche Lebendzell-Bildgebung
- Informieren Sie sich in unserem Katalog über das neue kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 von KEYENCE.
Häufige Fehler bei der Bilderfassung von lebenden Zellen
Ursache 3: Die Zelle verlässt den Betrachtungs- und Messbereich
Häufig verlassen die Zellen im Zuge des Experiments den Betrachtungs- und Messbereich. Wenn sich die Zelle aus dem Sichtfeld bewegt, bevor die Probenbetrachtung abgeschlossen ist, muss das gesamte Experiment wiederholt werden.
Die Zelle bewegt sich
Je länger das Experiment dauert, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Zelle aus dem Sichtfeld herausbewegt. Dagegen kann nichts unternommen werden, solange die Zelle lebendig ist. In einer Vielzahl von Arbeiten sind Daten vorhanden, die detaillierte Zellbedingungen zeigen. In vielen Fällen werden solche Daten durch wiederholte Bildaufnahmen bei hohen Vergrößerungen gewonnen, was mit einem hohen Arbeits- und Zeitaufwand verbunden ist.
Um Fehler zuverlässig zu verhindern, müssen Bilder von mehreren Stellen gleichzeitig erfasst oder sich bewegende Zellen während der Aufnahme verfolgt werden.
Gegenmaßnahmen
- Erfassen Sie einen breiten Betrachtungs- und Messbereich mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung.
- Erfassen Sie Bilder mehrerer Stellen gleichzeitig.
Sie können die Zellen präzise erfassen, indem Sie einen breiten Betrachtungs- und Messbereich mit geringer Vergrößerung beobachten. Die Details einer Zelle können jedoch mit einer geringen Vergrößerung nur schwer beobachtet werden. Je länger die Belichtungszeit, desto größer wird die Wahrscheinlichkeit, dass das Bild während der Bilderfassung unscharf wird.*10
- *10 Belichtungszeit und Bildunschärfe: Wenn Sie die Intensität des Anregungslichts verringern, muss länger belichtet werden. Wenn sich die Zelle bewegt, während die Verschlussblende geöffnet ist, wird das Bild unscharf. Der einfachste Weg, dieses Problem zu vermeiden, ist die Verwendung einer Kamera mit hoher Empfindlichkeit.
- Fluoreszenzmikroskope für eine erfolgreiche Lebendzell-Bildgebung
- Informieren Sie sich in unserem Katalog über das neue kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 von KEYENCE.
Gesteigerte Effizienz von Zeitrafferexperimenten
Bisher war es zur Erreichung besserer Forschungsergebnisse notwendig, Experimente zu wiederholen, um mehr Daten zu erhalten. Bei der Zeitrafferaufnahme nimmt jedoch ein einzelnes Experiment viel Zeit in Anspruch, sodass die Wiederholung von Experimenten umso zeitaufwändiger ist. Im Idealfall sollte ein einziges Experiment mehr Daten liefern.
Das kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 von KEYENCE löst dieses Problem mit der Zeitrafferaufnahmefunktion, indem eine vollautomatisierte Mehrpunkt-Bildaufnahme im Zeitverlauf erfasst wird. Es können bis zu 999 Punkte pro Experiment gleichzeitig unter völlig unterschiedlichen Bedingungen, wie z. B. Vergrößerungen von 2x, 4x oder 20x, gespeichert werden. Die Modellreihe BZ-X800 lässt sich einfach konfigurieren und verringert somit den Zeitaufwand, der üblicherweise für die Einrichtung des Systems und die Einarbeitung der Benutzer benötigt wird.
- Weitere Beispiele für den Einsatz des kompakten Fluoreszenzmikroskops BZ-X800 in der Forschung:
- [Myelodysplastische Syndrome (MDS)] Stitching, Sectioning und die Z-Stapelfunktion als entscheidende Argumente für die Anschaffung des Fluoreszenzmikroskops BZ am Universitätsklinikum Düsseldorf
- [Neuropathologie] Perfekte Lösung für den diagnostischen Alltag in der Krankenversorgung und der klinischen Forschung am Institut für Neuropathologie der Charité in Berlin
- [Regenerative Medizin] Essentielle Bildgebung für die Betrachtung der gesamten Wirbelsäule
- [Gentherapie] Probenbetrachtung in der Hirnforschung
- [Behandlung von Herzkrankheiten] Einfache Betrachtung vom gesamten Rattenherz bis hin zu dessen Zellen
- [Krebsbehandlung] Fluoreszenzmikroskop mit integrierter Dunkelkammer verändert die Forschung in starkem Maße
- [Immunsystem] Beitrag der Modellreihe BZ zum Verständnis des pathologischen Asthmamodells
- [Biomaterialien] Förderung der Effizienz in der Forschung mit kompakten, benutzerfreundlichen Mikroskopen