Hochauflösende Betrachtung von Golgi-gefärbten Hirnschnitten
Golgi-Färbung
Die Golgi-Färbung ist eine Silberfärbetechnik, die dendritische Dornen sichtbar macht, indem sie die Axone und Dendriten feiner Gehirnnervenzellen schwarz färbt. Sie wird seit langem zur Betrachtung der Struktur und der Veränderungen von Nervenzellen in Gehirnproben von Ratten und Mäusen verwendet.
Die Färbemethode nach Golgi wurde 1873 von Camillo Golgi, einem italienischen Nobelpreisträger für Physiologie oder Medizin, entdeckt. Er arbeitete an Experimenten zur Metallimprägnierung von Nervengewebe (Silberfärbung). Diese Methode wurde früher als „schwarze Reaktion“ bezeichnet, weil sich das feine Gewebe der Nervenzellen schwarz färbte, wenn eine Gehirnprobe, die mit einer Lösung aus Osmiumtetroxid und Kaliumdichromat fixiert wurde, in einer Silbernitratlösung gefärbt wurde. Die Golgi-Cox-Färbung, die 1891 von dem niederländischen Arzt Cox entdeckt wurde, verwendet verbesserte Verbindungen. Ein Hirnschnitt, der mit einer Mischung aus Kaliumdichromat-, Kaliumchromat- und Quecksilberchloridlösung fixiert wurde, wird schwarz, wenn er in eine Ammoniaklösung getaucht wird, was stabilere Ergebnisse liefert.
Die Golgi-Färbung und die Golgi-Cox-Färbung werden nach den jeweiligen Protokollen durchgeführt. Um eine höhere Arbeitseffizienz, einschließlich kürzerer Färbezeiten, und eine höhere Stabilität bei der Probenerstellung zu erreichen, wurden verschiedene Verbesserungen an dem Reagenz vorgenommen. Daher werden beide Färbemethoden nach wie vor für die Betrachtung von feinem Nervengewebe in Hirnschnitten verwendet. Diese Methoden färben nur bestimmtes Nervengewebe in einem Hirnschnitt, was sie für die Forschung zu verschiedenen Themen nützlich macht, z. B. um festzustellen, wie die Form und die Veränderung von Dendriten im Hippocampus die Kognition und die Gedächtnisbildung beeinflussen.
Hochauflösende Betrachtung von Golgi-gefärbten Hirnschnitten
Ein Gehirn erreicht höhere Funktionen, wie Gedächtnis und Emotionen, mit Hilfe von Netzwerken. Diese bestehen aus einem von jeder Nervenzelle ausgehenden Axon und einer großen Anzahl anderer Nervenzellen, die über Synapsen miteinander verbunden sind. Um Gehirne bei Experimenten und in der Forschung zu betrachten, werden aus einem Tiergehirn mehrere Proben hergestellt. Ein Gehirn wird mit einem Kryostaten bei niedrigen Temperaturen in gleich dicke Stücke geschnitten und nach den Protokollen für die Golgi-Färbung gefärbt.
Die Gehirne von Ratten und Mäusen, die als Proben verwendet werden, sind sehr klein und haben daher besonders feine Axone und Dendriten in ihren Nervenzellen. Gleichzeitig werden Hirnschnittproben mit einer gewissen Dicke erstellt, um die Struktur der Nervenzellen zu betrachten, was es schwierig macht, die gesamten Nervenzellen bei hoher Vergrößerung zu betrachten. Schon eine leichte Neigung oder ein geringer Höhenunterschied eines Objekts erschwert die Fokussierung. Bei Betrachtungen mit hoher Vergrößerung ist es wichtig, scharfe Bilder von Nervenzellen zu erhalten. Außerdem ist es wichtig, immer zu wissen, welcher Teil des Hirnschnitts betrachtet wird. Wenn die Vergrößerung erhöht wird, um die erforderliche Auflösung zu erreichen, wird das Sichtfeld kleiner. Um den gesamten Hirnschnitt zu verstehen, ist es notwendig, eine große Anzahl von Bildern aufzunehmen. Um Bilder mit hoher Vergrößerung, die es ermöglichen, sogar die Form von Nervenzellen zu erkennen, und Bilder mit niedriger Vergrößerung, die es ermöglichen, den gesamten Schnitt zu verstehen, nahtlos zu betrachten, müssen die Bilder zusammengefügt werden. Es ist jedoch mühsam und schwierig, zahlreiche Bilder mit hoher Vergrößerung aufzunehmen und zu verwalten und sie manuell zusammenzufügen. Dies erfordert viel Zeit und Arbeit.
Hochauflösende Betrachtung eines Hirnschnitts mit dem Fluoreszenzmikroskop BZ-X800
KEYENCE hat das Antriebssystem, einschließlich Fokussierung und Objekttischbewegung, vollständig motorisiert und vereinfacht damit verschiedene umständliche und komplizierte Prozess per Mausklick durchgeführt werden können. KEYENCE hat das kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 entwickelt, das sowohl scharfe Bilder mit hoher Vergrößerung aufnehmen als auch riesige Datenmengen speichern kann. So lässt sich die gesamte Probe untersuchen, da alle Arbeitsschritte – von der Aufnahme einer großen Bildanzahl bis hin zur anschließenden Analyse einschließlich Quantifizierung – besonders effizient sind.
Nahtlose hochauflösende Betrachtung von Bildern mit hoher Vergrößerung
Bei den folgenden Bildern handelt es sich um einen per Golgi-Färbung gefärbten Hirnschnitt einer Ratte, der mit dem Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 aufgenommen wurde.
Bei der Betrachtung, bei der nur ein Teil einer Probe fokussiert wird, weil diese geneigt ist oder Dicken- oder Höhenunterschiede aufweist, verwendet das BZ-X800 die Z-Stapel-Funktion, um automatisch mehrere Bilder in Richtung der Z-Achse aufzunehmen, und die Vollfokussierungsfunktion, um nur die Teile jedes Bildes zusammenzusetzen, die im Fokus sind, was eine einfache Aufnahme vollständig fokussierter Bilder ermöglicht. Dadurch lassen sich feine Nervenzellen und Golgi-gefärbte schwarze Schnitte deutlich erkennen.
Darüber hinaus ist das BZ-X800 mit einer Bildzusammensetzungsfunktion ausgestattet, die mehrere hochauflösende Bilder bei hoher Vergrößerung aufnimmt, während der motorisierte Objekttisch in X- und Y-Richtung in einem Bereich bewegt wird, der durch drei Koordinaten auf dem Umriss eines Objekts festgelegt ist. Dies ermöglicht die Aufnahme eines hochauflösenden, vollständig fokussierten Bildes des gesamten Hirnschnitts, der zu groß wäre, um bei hoher Vergrößerung in ein einziges Sichtfeld zu passen.
Die Vollfokussierungsfunktion und die Bildzusammensetzung können zusammen verwendet werden, sodass der Benutzer feine Nervenzellen bei hoher Vergrößerung betrachten kann und dabei immer weiß, welcher Teil des Hirnschnitts gerade betrachtet wird.
Ein Bild, das über das gesamte Sichtfeld fokussiert ist, kann mit der Vollfokussierungsfunktion erstellt werden, die nur die fokussierten Abschnitte aus mehreren Bildern zusammensetzt, die bei verschobener Z-Achse aufgenommen wurden. Außerdem kann ein Bild des gesamten Hirnschnitts mit hoher Auflösung erstellt werden, indem mehrere Bilder mit hoher Vergrößerung, die während der Bewegung des Objekttisches aufgenommen wurden, zu einem Bild zusammengefügt werden.
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Z-Stapel
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Omnifokal
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Bildzusammensetzung
Objektiv: CFI Plan Apo λ 10x
Bildzusammensetzung: 16 Bilder x 13 Bilder
Zählungen und Messungen direkt an der Aufnahme
Die vom BZ-X800 aufgenommenen scharfen Bilder ermöglichen nicht nur die Betrachtung, sondern auch eine schnelle quantitative Messung und Analyse anhand derselben Bilder.
Die Funktion Hybride Zellzählung legt einen ganzen Abschnitt als Maskenbereich fest und extrahiert und quantifiziert bestimmte Zellen in diesem Bereich auf der Grundlage von Unterschieden in Farbe und Helligkeit. Mit dieser Funktion kann der Anteil der Nervenzellen im gesamten Hirnschnitt automatisch berechnet und die Daten im Tabellenkalkulationsformat ausgegeben werden. Diese Funktion verfügt auch über einen Phasenkontrastmodus, der kultivierte Zellen extrahiert und zählt, ohne durch ungleichmäßige Helligkeit im Hintergrund beeinträchtigt zu werden, was eine genaue quantitative Analyse auch von kultivierten Nervenzellen ermöglicht.
Darüber hinaus kann die Messzeit durch die Verwendung von Zellzähl-Makros zur Verarbeitung eines Stapels von Bildern auf der Grundlage der mit hybrider Zellzählung extrahierten Bedingungen erheblich verkürzt werden. Die manuelle quantitative Analyse jedes einzelnen Bildes ist sehr zeit- und arbeitsaufwändig und birgt zudem das Risiko, dass die Messbedingungen von Bediener zu Bediener variieren. Die Verwendung der hybriden Zellzählung liefert schnell sehr zuverlässige Daten ohne Fehler, die durch unterschiedliche Bedingungen verursacht werden.
Vielseitigkeit mit einem einzigen Gerät
Das BZ-X800 ist, wie die Bezeichnung kompaktes Fluoreszenzmikroskop schon andeutet, mit einer hochempfindlichen, hochauflösenden gekühlten CCD-Monochromkamera und einer Dunkelkammer ausgestattet, die eine fortschrittliche Fluoreszenz-, Hellfeld- und Phasenkontrastbetrachtung und -analyse ermöglicht. Das BZ-X800 unterstützt sowohl Multi-Well-Platten als auch Golgi-gefärbte Hirnschnitte mit einem einzigen Gerät, sodass es sowohl eine klare Betrachtung verschiedener Proben als auch eine genaue Messung und Auswertung ohne Fehler durchführen kann. Und da nur ein einziges Gerät für die Betrachtung und Analyse verschiedener Proben benötigt wird, hilft das BZ-X800, Platz im Labor zu sparen.
Verwendung des kompakten Fluoreszenzmikroskops BZ-X800
- Wenn ein Objekt zu groß ist, um bei hoher Vergrößerung in ein einzelnes Sichtfeld zu passen, kann die Bildzusammensetzung, bei der automatisch mehrere Bilder aufgenommen und zusammengefügt werden, leicht ein Bild mit einem großen Sichtfeld, das das gesamte Objekt darstellt, und einer hohen Auflösung bei hoher Vergrößerung erzeugen.
- Die Z-Stapel-Funktion nimmt mehrere Bilder mit unterschiedlichen Brennweiten auf, und die Vollfokussierungsfunktion erzeugt ein vollständig fokussiertes Bild, indem sie nur die Bereiche aus jedem Bild kombiniert, die am schärfsten sind.
- Die Funktion Hybride Zellzählung kann Zellen des Objekts genau extrahieren und zählen. Der Anteil kann berechnet und als Daten im Tabellenkalkulationsformat ausgegeben werden.
- Auf der Grundlage der mit der hybriden Zellzählung extrahierten Bedingungen können Zellzähl-Makros verwendet werden, um einen Stapel von Bildern schnell zu verarbeiten.
- Das BZ-X800 ermöglicht die Fluoreszenz-, Hellfeld- und Phasenkontrastbetrachtung und -analyse verschiedener Proben mit einem einzigen Gerät und spart daher Platz im Labor.
- Weitere Beispiele für den Einsatz des kompakten Fluoreszenzmikroskops BZ-X800 in der Forschung:
- [Myelodysplastische Syndrome (MDS)] Stitching, Sectioning und die Z-Stapelfunktion als entscheidende Argumente für die Anschaffung des Fluoreszenzmikroskops BZ am Universitätsklinikum Düsseldorf
- [Neuropathologie] Perfekte Lösung für den diagnostischen Alltag in der Krankenversorgung und der klinischen Forschung am Institut für Neuropathologie der Charité in Berlin
- [Regenerative Medizin] Essentielle Bildgebung für die Betrachtung der gesamten Wirbelsäule
- [Gentherapie] Probenbetrachtung in der Hirnforschung
- [Behandlung von Herzkrankheiten] Einfache Betrachtung vom gesamten Rattenherz bis hin zu dessen Zellen
- [Krebsbehandlung] Fluoreszenzmikroskop mit integrierter Dunkelkammer verändert die Forschung in starkem Maße
- [Immunsystem] Beitrag der Modellreihe BZ zum Verständnis des pathologischen Asthmamodells
- [Biomaterialien] Förderung der Effizienz in der Forschung mit kompakten, benutzerfreundlichen Mikroskopen